|
|
Comparison of biotechnological procedures for pure proteins preparation
Bušanski, Patrik ; Langová, Denisa (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
The production of recombinant proteins is a biotechnological process during which proteins are produced in foreign organisms by gen manipulation. To form a recombinant plasmid the gene encoding the desired protein is isolated and inserted into an expression vector. The plasmid is then transformed using physical or chemical method into a suitable host, where the recombinant gene is translated into amino acid sequence in the newly synthetized protein. The theoretical part of this bachelor thesis includes characteristics of proteins, methods of recombinant protein preparation and compares individual expression systems. Three isoforms of the p53 protein, which were synthesized in the E. coli microorganism, were selected for processing the experimental part. The transformed recombinant plasmid contained two tags for purification, HIS-tag and GST-tag, making it possible to compare the efficacy of the two purification methods. HIS-tag purification was found to work for all three isoforms better, with concentrations of recombinant proteins were several times higher than those of the GST-tag. The p53 proteins are about 50 kDa long, what was confirmed by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis.
|
|
|
Influence of cultivation conditions on the production of recombinant proteins
Gardošová, Zuzana ; Nováčková, Ivana (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Recombinant proteins are produced by using genetic modifications. In this process is insert contained gene encoding a certain protein in a cloning vector cloned into the host organism. Recombinant proteins are expressed after the transformation of the cloning vector into a host, the host organism. The expression of recombinant proteins in bacterial cells is one of the most efficient ways to manufacture these proteins. The p53 protein is a tumor suppressor protein, the main role in cells is to react on DNA damage. Due to the reaction to various intracellular and extracellular stimuli, including DNA damage, the p53 protein shows different biological functions, including regulation of senescence, cell cycle, or apoptosis. The theoretical part of the thesis part presents the basic properties of proteins, methods of recombinant protein expression, methods of protein isolation, and characterization of p53 protein. The aim of the experimental part was to determine the effect of incubation temperature on recombinant p53 protein production. The work involves the isolation of plasmid DNA and its transformation into E. coli production cells. The produced proteins were successfully isolated and subsequently characterized by SDS-PAGE and Western Blotting.
|
|
|
Dominantní proteinové antigeny Toxocara canis
Skulinová, Kateřina ; Kašný, Martin (vedoucí práce) ; Panská, Lucie (oponent) ; Vadlejch, Jaroslav (oponent)
Larvální toxokaróza je celosvětově rozšířená zoonóza vyskytující se v rozvinutých státech i zemích třetího světa. Původcem onemocnění jsou škrkavky rodu Toxocara, primárně střevní paraziti psů, koček a dalších šelem. Životaschopnými vajíčky, uvolněnými do prostředí se stolicí psa, se mohou nakazit nejen definitivní hostitelé, ale také hostitelé parateničtí, mezi které kromě mnoha obratlovců a některých bezobratlých patří i člověk. U člověka může migrace larev způsobit vážné a nenávratné poškození tkání, které je charakterizováno různými klinickými formami onemocnění. Pro účely rutinní diagnostiky larvální toxokarózy je dosud nejčastěji využívanou metodou ELISA a Western blot, které umožňují průkaz reakce specifických protilátek s larválním exkrečně-sekrečním produktem (TES). TES je pro účely diagnostiky získáván z larev kultivovaných larev v živném médiu. Příprava takové antigenní směsi je velmi pracná a v jednotlivých laboratořích se může lišit. Současný výzkum v oblasti diagnostiky larvální toxokarózy je proto zaměřen i na standardizaci sérodiagnostických postupů. Zásadní předpokladem je znalost detailního složení TES, zejména antigenních (proteinových) molekul. U Toxocara canis je však počet prací věnujících se charakterizaci TES produktů larev zatím stále velmi omezen.
|
|
|
Optimalizace kultivačních podmínek vybraných kmenů \kur{E.coli} produkujících rekombinantní proteiny
MICHALCOVÁ, Zuzana
Bakterie Escherichia coli je jedním z nejvíce preferovaných organismů pro produkci rekombinantních proteinů. E. coli je velmi dobře zavedeným hostitelem, který nabízí snadnou genetickou manipulaci, krátkou dobu kultivace, schopnost kontinuální fermentace a cenově dostupná kultivační media. Pro dosažení vysoké úrovně proteinové exprese, a tedy vysoké produkce rekombinantního proteinu je třeba provádět optimalizace kultivačních podmínek. Právě na optimalizaci kultivace se zaměřuje tato diplomová práce, kde praktická část je zaměřena na produkované enzymy uridin fosforylázu (UP) a purin nukleosid fosforylázu (PNP). Bakterie E. coli produkující UP nebo PNP byly kultivovány na šesti mediích s různými zdroji živin. Produkce proteinů byla ověřena na spektrofotometru metodou dle Bradfordové a dále pomocí polyakrylamidové gelové elektroforézy s SDS (SDS-PAGE). Aktivita enzymů byla měřena HPLC analýzou. Dále byla u všech vzorků stanovena sušina. Na základě výsledků z těchto analýz bylo vybráno medium Terrific Broth s přídavkem glukózy po 4 hodinách kultivace (TBG4), které bylo následně použito pro upscaling do fermentoru. Úspěšná kultivace ve fermentoru potvrdila výsledky kultivace v Erlenmeyerových baňkách.
|
|
|
Příprava mutantního serpinu z klíštěte \kur{Ixodes ricinus}
EDEROVÁ, Monika
Do P1 místa serpinu Iripin-1 pocházejícího ze slin klíštěte Ixodes ricinus byla pomocí specifických primerů zavedena bodová mutace zaměňující arginin za tryptofan. Protein obsahující tuto mutaci byl exprimován v chemicky kompetentních buňkách Escherichia coli. Následně byl z těchto buněk extrahován a přečištěn pomocí afinitní a rozměrově-vylučovací chromatografie. Aby byl ověřen dopad zavedené bodové mutace, byla otestována schopnost získaného proteinu tvořit kovalentní komplexy s trypsinem.
|
|
|
Role posttranslačních modifikací tubulinu v regulaci mikrotubulárních procesů
Šliková, Pavlína ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Libusová, Lenka (oponent)
Mikrotubulární cytoskelet hraje zásadní roli v nejrůznějších buněčných pochodech, jako je vnitrobuněčný transport, buněčná motilita či segregace chromosomů při buněčném dělení. Tubulin, stavební jednotka mikrotubulů, prochází mnohými posttranslačními modifikacemi, které ovlivňují dynamiku mikrotubulů, jejich organizaci a interakci s dalšími proteiny. Porozumění tomu, jakou roli posttranslační modifikace hrají v zajištění rozmanitých funkcí a vlastností mikrotubulů, je klíčové k pochopení dynamiky mikrotubulárního cytoskeletu jako celku. Přesné mechanismy, jakými posttranslační modifikace na mikrotubulární cytoskelet působí, však nejsou zcela objasněny. V této práci byl zkoumán vliv přítomnosti posttranslačních modifikací na růst mikrotubulů a na jejich interakci s motorovým proteinem kinesinem-1. Pomocí fluorescenční mikroskopie s úplným vnitřním odrazem a interferenční reflekční mikroskopie bylo zjištěno, že vysoká míra posttranslačních modifikací na mikrotubulech snižuje délku jejich interakce s kinesinem, zatímco afinita kinesinu k mikrotubulům a průměrná rychlost, kterou se po nich pohybuje, se u vysoce a málo modifikovaných mikrotubulů významně neliší. Dále bylo zjištěno, že absence polyglutamylace na podjednotkách tubulinu vede k rychlejší polymerizaci mikrotubulů. Tyto výsledky ukazují, že...
|
|
|
Příprava a charakterizace lidských buněčných kofaktorů retrovirové integrace
Čermáková, Kateřina ; Maloy Řezáčová, Pavlína (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
LEDGF/p75 je lidský buněčný vazebný partner integrasy viru HIV-1. Jak prokázaly nedávné studie, LEDGF/p75 hraje zásadní roli v replikačním cyklu tohoto viru. Jeho funkce v procesu retrovirové integrace je velice dobře prostudována. Byla identifikována doména zodpovědná za interakci s virovou integrasou (IBD) a byly provedeny strukturní studie, které poskytly detailní informace o této interakci. Ostatní jeho úlohy však zatím příliš charakterizovány nejsou. Je jisté, že jako transkripční faktor zasahuje nejen do replikace viru HIV-1, ale také do procesů spojených s buněčným stresem, autoimunity a rozvoje některých druhů rakoviny. Dodnes bylo odhaleno několik přirozených vazebných partnerů LEDGF/p75, jejichž vazba na tento protein je zprostředkovávána stejnou doménou jako vazba intergasy viru HIV- 1; jedním z nich je i protein PogZ. Bylo prokázáno, že vzájemná interakce LEDGF/p75 a PogZ je u obou těchto proteinů zajištěna jejich C-koncovými úseky. Abychom získali informace o této interakci a o topologii vazebných míst LEDGF/p75 a PogZ, rozhodli jsme se provést strukturní studii jejich vazebných domén. Tato strukturní studie je zásadní pro pochopení přirozené buněčné funkce LEDGF/p75 a může pomoci ve vývoji inhibitoru specificky blokujícího interakci LEDGF/p75 a virové integrasy, aniž by došlo k narušení...
|
|
|
Studium receptor-ligandového páru NKR-P1F a Clrg
Kotýnková, Kristýna ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Schneider, Bohdan (oponent)
Studim receptor - ligandového páru NKR-P1F a Clrg Myší receptor - ligandový pár NKR-P1F a Clrg je důležitou součástí receptorového "zipu", který vzniká při kontaktu mezi NK buňkou a cílovou buňkou. Tento pár představuje jeden z příkladů nedávno objevených interakcí typu lektin-lektin, které jsou důležité při rozpoznání u mnoha imunocytů. Za účelem studia struktury těchto proteinů a jejich vzájemné interakce byly připraveny vektory pET-30a(+) pro bakteriální expresi. Tyto vektory kódovaly části extracelulárních domén obou proteinů. Po indukci IPTG byly proteiny produkovány ve formě inkluzních tělísek, ze kterých byly renaturovány in vitro. Renaturované proteiny byly purifikovány kombinací ionexové a gelové chromatografie. Konstrukt pro protein NKR-P1F poskytoval při použití standardních renaturačních protokolů pouze malé výtěžky solubilního proteinu, a navíc vyvstaly problémy s reprodukovatelností výsledků renaturace. V případě Clrg nebyly standardní postupy skládání úspěšné. Kvůli tomu bylo přistoupeno k mutaci lichého cysteinu, který nezapadal do obvyklého vzoru pro tyto receptory. Cystein byl mutován na serin a produkt výsledného C148S konstruktu již bylo možnorenaturovat in vitro. Dále bylo zjištěno, že přídavek (benzyldimethylamonnia)propansulfonátu do renaturačního pufru zvyšuje výtěžek solubilního...
|
|
|
Influence of cultivation conditions on the production of recombinant proteins
Gardošová, Zuzana ; Nováčková, Ivana (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Recombinant proteins are produced by using genetic modifications. In this process is insert contained gene encoding a certain protein in a cloning vector cloned into the host organism. Recombinant proteins are expressed after the transformation of the cloning vector into a host, the host organism. The expression of recombinant proteins in bacterial cells is one of the most efficient ways to manufacture these proteins. The p53 protein is a tumor suppressor protein, the main role in cells is to react on DNA damage. Due to the reaction to various intracellular and extracellular stimuli, including DNA damage, the p53 protein shows different biological functions, including regulation of senescence, cell cycle, or apoptosis. The theoretical part of the thesis part presents the basic properties of proteins, methods of recombinant protein expression, methods of protein isolation, and characterization of p53 protein. The aim of the experimental part was to determine the effect of incubation temperature on recombinant p53 protein production. The work involves the isolation of plasmid DNA and its transformation into E. coli production cells. The produced proteins were successfully isolated and subsequently characterized by SDS-PAGE and Western Blotting.
|
|
|
Structure and dynamics of mouse C-type lectin-like receptors.
Wallenfels, Lucie
NK buňky jsou schopné rychle rozpoznat buňky infikované virem nebo také nádorové buňky a podílí se na regulaci odpovědí adaptivní imunity, proto představují velmi důležitou součást přirozené imunity. Funkce NK buněk jsou zajišťovány souhrou mezi jejich receptory, které dohromady vytváří složitý regulační systém. Vyřešení struktury jednotlivých receptorů by mohlo přispět k porozumění NK- buněčné biologie. Předkládaná dizertační práce je věnována řešení struktury inhibičního receptoru C-lektinového typu (CTLR) Nkrp1b, především je pak zaměřena na ty části jeho struktury (krček, smyčka a oligomerní stav), které mohou ovlivnit celkovou konformaci receptoru a také jeho interakce. Vazba receptoru Nkrp1b s jeho ligandem, proteinem Clr-b, je imunologicky významná, jelikož nezávisle reguluje aktivitu NK buněk a monitoruje změny, které nejsou detekovatelné cytotoxickými T lymfocyty. Aby mohly být studovány jednotlivé strukturní charakteristiky proteinu Nkrp1b, byly připraveny dvě jeho varianty: celá ektodoména a ligand-vazebná doména postrádající krček. S využitím několika různých technik hmotnostní spektrometrie v kombinaci s homologním modelováním a molekulární dynamikou byla navržena struktura receptoru Nkrp1b včetně jeho monomerního a dimerního uspořádání. Dále byl zkoumán oligomerizační stav receptoru...
|
host ::
RSS.